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Detection of IL-13

Summary

ELISA is highly specific for human or mouse IL-13 and does not recognize other cytokines in the sample. Author: J.E. Colligan et al, Translator: Xuitao Cao et al. This experiment is from the "Compendium of Immunology Laboratory Guide".

Operation method

Detection of IL- 1 3

Move

basic program Material 包被抗体:纯化的抗人IL-13单 克 隆 抗 体 (JES10-35G 1 2 鼠 IgG2a; 从 A T C C 获得, 得 到 D N A X 许可),抗人单克隆抗体M A B 213 (R & D Systems) ,或抗小鼠单克隆抗体 M A B 413 (R & D Systems) V P B S 封闭溶液: 2 0 % (V /V ) FBS (56°C 热 灭 活 lh) , P B S 配 制 (无菌过滤, 4°C 保存) 10ng/ml IL-13 标 准 品 (PepeoTech) V R P M I-IO 完全培养基 待测样品 洗涤缓冲液: 0.05% (V/V) Tween 20, PBS配 制 (室温保存不超过2 周) 生 物 素 结 合 的 二 抗 (JES10-2E 1 0 抗 人 IL-1 3 ; 从 A T C C 获 得 ,得 到 D N A X 许 可 ;
单 元 4.1),生物酰化的抗人多克隆抗体B A F 213 (R & D Systems) ,或生物酰 化的抗小鼠多克隆抗体B A F 413 (R & D Systems) 二抗稀释缓冲液: 1%(饥 /7) 3 3 八 / 0 . 0 5 % 〇 ^ ) ? 8 3 配 制 的 丁 评 沈 1 1 2 0 〇 / 7 7 ) 辣 根 过 氧 化 物 酶 (H R P ) 结 合 的 链 亲 和 素 (Jackson Immunoresearch) V 底物溶液 检 测 板 :9 6 孔圆底聚乙烯微量板(Dynatech) 9 6 孔聚苯乙烯微量板 微 量 板 洗 涤 仪 (如 E lcatech的 Elcawash) 或塑料洗瓶 微 量 板 读 板 仪 (酶联仪) 1 . 用 P B S 稀释包被抗体至浓度为5Mg/m l 。立即加入至检测板,每 孔 加 50M1,盖上盖 子 , 37°C 孵 育 2h ,或 4°C 过夜。 不 应 有 其 他 蛋 白 存 在 ,防 止 其 与 抗 体 竞 争 性 结 合 板 上 的 结 合 位 点 。 2 . 每孔加入150jul封闭液以封闭包被好的检测板上多余的蛋白结合位点(包被抗体无 需去除)。 37°C 孵 育 20min。 3 . 在封闭检测板的同时,在 9 6 孔板中用R P M I -1 0 完全培养基对10ng/mlI L -13标准品 进 行 2 倍比梯度稀释。设置好板中所要加50^1体 积 稀 释 物 的 位 置 (如 一 行 的 1 1 个 孔),最后一个孔加培养基作为空白对照。每个稀释度做2 个复孔。用盖子或塑料包 被物完全盖住检测板。 4 . 用 R P M I -I O 完全培养基2 倍比系列稀释待测样品, 50M1体 积 , 2 个复孔。 5 . 采用微量板洗涤仪或洗瓶用洗涤缓冲液彻底洗涤检测板。一个方向上漂洗2〜3s,然 后 旋 转 180°重复洗涤。用力甩出残留液体,在吸水纸上拍干。 6 . 将稀释好的标准品和待测样品转移到检测板中。盖上盖子,室 温 孵 育 2h 。用力甩出 样品,按照步骤5 洗板。 7 . 用二抗稀释缓冲液稀释生物素偶联抗体至lMg/ml。每 孔 加 50M1,盖上盖子,室温孵 育 45min。用力甩出液体,按 步 骤 5 洗板。 8 . 按照生产商说明书用二抗稀释缓冲液稀释H R P 偶联的链亲和素至最佳浓度。每孔加 5〇 W ,盖上盖子,室温孵育45min。用力甩出结合液,按 步 骤 5 洗板。 9 . 每孔加入100/xl新鲜配制的底物溶液,室温孵育50〜60m i n 直到出现绿色。 1 0 . 以 405n m 为测定波长, 490n m 为参照波长用酶联仪读取最佳密度值。 11. 根 据 IL-13数据绘制标准曲线。确定未知样品中IL-13的浓度。确保未知样品的数 据点落在标准曲线的线性范围内。


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