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Polyomavirus: SV40

Summary

This chapter describes how to construct H S V /A A V heterotrimeric vectors using an unassisted viral packaging system, and also discusses its advantages and disadvantages compared with conventional H V S /AAV amplicon vectors. Author: T. Friedman et al, Translated by W. Qin et al. This experiment is from "Gene Transfer".

Operation method

Construction of SV40-derived vectors

Move

Construction of SV40-derived vectors Materials

reagents
COS-7 Cells (A T C C )

Cells were cultured in 75 cm2 cell culture flasks with DMEM-IO and passaged every 3~4d.
Cesium chloride gradient solution (1.28 g/m l and 1.50 g/m l)

30 g and 40 g of solid CsCl were dissolved in 70 ml and 50 ml of 0- 02 mol/L Tris-HCl (pH 7. 4), respectively. Im l of each solution was taken and weighed on an analytical balance to determine density. The solutions were sterilized by filtration using a 0.22Pl membrane.

Dual Decontaminants

5 % Decholate (Sigma-Aldrich)

10% Triton X-IOO (Sigma-Aldrich)

Dulbecco's basic medium (D M E M ; G I B C O B R L )

Sterilize by filtration with a 0.22um membrane.

Ethanol (70% V/V)

F u G E N E -6 Transfection Reagent (Roche)

Growth medium (p H 7. 4) (D M E M -10)

D M E M

10 % normal calf serum (C a m b r e x )

1 % Penicillin/Streptomycin (Cellgro)

1 % L-glutamic acid (Cellgr0)

Sterilize by filtration with a 0.22um membrane.

Maintenance medium (p H 7. 4) (D M E M -2)

D M E M

2 % normal calf serum (C a m b r e x )

1 % Penicillin/Streptomycin (Cellgro)

1 % L-glutamic acid (Cellgr0)

Sterilize by filtration with a 0.22pm membrane.

10 X phosphate buffer (P B S )

2 g K C l

80 g NaCl

14.4 g N a 2 H P 0 4

2.4 g K H 2P 0 4

Dissolve in IL double distilled water (WdH2O). Prior to use, dilute 10 X reservoir solution with double-distilled water to I X PBS. adjust pH to 7.4. sterilize by filtration with a 0.22 pm membrane.

rSV40 DNA

Viral genomic DNA containing the desired transgene is excised from the vector plasmid, gel purified, and then recirculated using standard techniques.

Trypsin/ E D T A (Cellgro)

Water, double-distilled

Instrumentation

Cell scraper (sterilized, separately packaged)

Centrifuge tubes (plastic, clean, and clear; b e c k m a n )

Sterilize centrifuge tubes by soaking in 70% ethanol for at least 15 minutes at room temperature before use.

CO2 incubator (maintain 37°C, 5 % to 6 % C02; NAPCO)

Freezing tube (I.5mL; Nalgene)

Dialysis buoys and dialysis cards (0.5-3.O m l ; Pierce)
Eppendorf 管 （I.5ml) 冰 箱 （一80°C ; Revco) 无菌层流操作台 显 微 镜 （明场） 针 头 （18号，灭菌，单独包装） 微量移液器（灭菌，单独包装， 2ml、 5m l和 10ml; Fisher) 移 液 器 （l 〇 ml、 IOOml 和 1000ml; Ranin) 注 射 器 （3. Oml和 5. 0ml，灭菌） 组织培养皿（100mm; Corning) 组织培养瓶（75cm2; Corning) 超速离心机 （Beckman) 带 SW 2 8 . 1 转子和配套容量桶（bucket) 使用前SW 28.1和容量桶要高压灭菌。 涡旋混合器 恒温水浴超声破碎仪 方法 1.转染前一天，从已汇合的两瓶COS-7细胞中吸出DMEM-10培养液。用 lml PBS 清洗。 这里使用的体积是针对I O O m m 培养皿。更小或更大的样品根据数量做相应调整(表2 ) 。 表 2 . 转染条件 培 养 皿 / m m DNA/^tg * D M E M / m undefined lipid/^iundefined 60 1〜5 200 3〜15 100 8〜12 500 24〜36 150 15〜20 800 45〜60 * 表示每个培养皿。 2 . 吸出PBS。加 人 Im l胰酶/EDTA。 3. 37°C孵 育 Im in或直到细胞开始从瓶底脱落。 在明视野显微镜下观察细胞的状态。 4. 一旦细胞脱落后，各个培养瓶中加人IOml DMEM-10。将细胞悬液转移到一个瓶中。 5. 将悬浮的细胞转移到8 个 IOOmm组织培养皿中。 37°C ， 5 % CO2 培养过夜。 细胞在转染前应当有60%〜80%的汇合度。 6 . 吸去培养液。加 8mlDMEM-2到每个盘中。放回培养箱中。 7. 准备转染试剂，每个盘使用单独的Eppendorf管。 a. 每 个 1.5m l管中加人500卩1 DMEM (无血清、抗生素、谷氨酸盐)。 b. 每管中加人30fxlFUGENE。轻轻吹打混合均匀。 直接把Fugene加人到DMEM中，避免接触到管壁。 c•其中6 管中每管加人10陴rSV40 DNA。轻轻吹打混合均勻。
第 7 管 （不 加 DNA) 作为阴性对照。第 8 管 中 加 人IOfXg表达对照的质粒DNA (如表达增 强绿色突光蛋白）作为阳性对照。 d• 室 温 孵 育 约 20m in 。 8•将组织培养皿从培养箱中取出。 一 滴一滴地加入liPid/DNA混合物到每个盘中。晃 动培养皿使试剂分散均匀。 9. 将培养皿放回培养箱， 37°C 5 % CO2培 养 72h。 48h 后，检査阳性和阴性对照，观察细胞毒性和转染效率。 10. 转染后72h ，轻轻将细胞刮到细胞培养液中。 每个培养皿要使用单独分装的无菌细胞刮刀。 11•将细胞溶液转移到15m l或 50m l (取决于总体积）锥底离心管中。轻轻吹打细胞, 使成团细胞分散开来。 12. _80°C冷冻，然后室温解冻3 次。 13. 在水浴超声破碎仪中超声裂解细胞。 裂解液可以在一 80°C中保存几个月 1 4 . 每 IO m l裂解液中加人I m l双重去污剂。涡旋混合。 冰 上孵育15m in 。 15. 将裂解液转移到离心管中。将离心管放到SW 28桶中。 使 用 DMEM平 衡 各 管 。尽 管 桶 只 用 到 部 分 ，但 是 桶 里 所 有 管 都 要 离 心 。空桶要用水来 平衡。 16. 4°C » 16 000尽离心20111丨11除去细胞碎片。 17•转移上清到15m l锥底离心管。弃去沉淀。使用DMEM调整体积到13ml。 18. 加 人 2. 5ml I .28g/ml CsCl溶液到干净的塑料管中。再 加 人 I .5ml L 50g/ml CsCl 溶液。 19. 小心地把前面得到的13m l上清加到CsCl溶液里。避免混合各层溶液。 20. 将管放到桶里。按步骤15平衡^ 4°C ， 22 500r/m in离 心 3.5h。 21. 使 用 18号针插入到每管的底部。 22. 收集0. 5m l层分到E p p e n d o rf管中。 病毒离心后，大部分位于两种CsCl溶液的交界面处，应 该 是 第 3〜6 层 。当这一交界面达 到管底时会出现明显的流速改变。 23. 收集含有病毒的层分，以及前一层的层分和后一层的层分。 24. 使 用 Pierce 0. 5〜3m l透析盒在PBS中透析收集到的病毒3 次。 每轮透析时， Im l透析样品使用IL PBS。

Titration of replication-deficient rSV40 Material 试剂 Brilliant S Y B R G r e e n Master M i x (Stratagene) 试剂融化后在4°C保 存 。试 剂 盒 中 的 SYBR G reen和 R O X 成 分 对光线敏感，应尽量避光 保 存 。 D N A 引 物 （Integrated D N A Technologies) 正 向 引 物 ： T 7 . 1. f w ; 5' A A A C A G A T C A G A T C C A G A C A T G A T 3' 反 向 引 物 ： T 7. 277. r v ; 5 'A T T C G C C C T A T A G T G A G T C G T A T T 3' 这 些 引 物 和 载 体 上 的 非 S V 4 0 序 列 复 性 结 合 ，得 到 277bP 的 扩 增 产 物 。 T 7.1.f w 和 T 7. 277. rv在 lOOmmol/L 盐 浓 度 下 的 熔 解 温 度 分 别 为 63. 99°C 和 64. 48°C , G /C 含量为 38. 4 6 % 和 41. 6 7 % 。它 们 都 是 2 4 个核苷酸。 磷 酸 盐 缓 冲 液 （P B S ) P l a s m i d M a x i K i t (Q I A G E N ) R N a s e (500n g //ul; R o c h e Applied Sciences 1119915) < ! 〉 R Q l D N a s e (1U //J ; P r o m e g a ) 在使用新开封的DNase前 ，要测定消除非衣壳化的D N A 所需要的最小酶浓度。用 O〜 DNase设置几个质粒D N A 反应。用下面提到的方法进行酶切、失 活 、 q P C R ,作标准曲线。 使质粒模板减少到没有酶切的对照的2 lo g 以上的DNase浓度可以用来处理病毒样品。 R Q l D N a s e 反 应 缓 冲 液 400m m o l / L Tris ( p H 8. 0) < ! > 100m m o l / L M g S 0 4< ! > l O m m o l / L CaCl2<C ! > R Q l D N a s e 终 止 液 20m m o l / L E G T A ( p H 8. 0) Tris-HCl (l m o l / L , p H 7. 5 ; 无 核 酸 酶 ；Fisher) 使用前用无核酸酶的水稀释成l〇 m m d / L Tris-H C l ， p H 7. 5 水 （P C R 级 别 ；无 核 酸 ；Fisher) 仪器 微 量 离 心 管 （无 核 酸 酶 ， Fisher) 微 型 离 心 机 M x 3000P q P C R Instrument (Stratagene) 或 其 他 q P C R 仪 器
q P C R 光学管和盖（8Xstrip，无核酸酶；Stratagene) Sharp precision barrier tips (无核酸酶；Denville Scientific) 涡旋混合器 测定标准曲线 1•用Q I A G E N Plasmid M a x i Kit提取作标准曲线用的质粒D N A 。 在 O D 26。定 量 。 用作储液所需的DNA量取决于质粒的大小；1 畔 I k b 的 DNA等于 9. IX lO u 个分子的双链 基因组DNA。 所以 5 X 10 9 个 分 子 的 Ikb DNA等 于 5. 49ng。 2. 用质粒大小乘以5. 49来 计 算 5X I O 9个分子的质粒所需要的D N A 质量。 3 . 用 1 0 m m 〇 l/L Tris-HCl稀释质粒以得到5. OXlO9 个分子/M 1的储液。 4•在OD26。对 DNA定量以检查储液浓度，必要时做相应调整。分装并于一2(TC保存。 5• 解 冻 5 X IO 9 个 分 子 /f j 的 储 液 ， 涡 旋 混 合 后 瞬 时 离 心 。 6 . 准备浓度 5 X IO 8〜5 X IO 2 的 1 0 倍系列稀释液。 a•每次稀释，将 1 0 ^ 1前一次高浓度的溶液加人到90M 1 1 0 m m o l /L T r i s- H C l ( p H 7 _ 5 ) 中。 b. 每 间 隔 3〜5s 祸旋混合均匀。 c. 使用微型离心机瞬时离心每个浓度的稀释液。 每次冷冻的储液都要用新的稀释液作标准曲线。稀 释 的 DNA样 品 不 能 长 期 保 存 ，在一 2〇°C容易产生沉淀。 DNase和 RNase酶切纯化的r S V 40 7•再次使用P B S 透 析 IOOfiI 已经纯化的rS V 40 (从方 案 1 的步骤2 4 中得到）， 去除所 有可能抑制q P C R 的成分，如去污剂。立即使用或保存于一8CTC。 8 . 融 解 R Q l D N a s e 反应缓冲液。涡旋混合。 确保盐分都溶解了。如果有白色沉淀，在 37〜50°C孵育缓冲液，然后涡旋混合。 9 . 按 1 : 100 比例用 10mmoI/L Tris-HCl ( p H 7. 5 ) 稀释 RNase。放置在冰上。 每天都要更新稀释液。 1 0 . 冰 上 （约 4°C ) 解 冻 r S V 4 0 。 11•用 D N a s e / R N a s e 酶切纯化的 r S V 4 0 。 a•将Ijul RQl D N a s e 反应缓冲液和I mI 稀 释 的 R N a s e G n g / j u D 混合。加人适当体 积 的 10mmol/L Tris-HCl使最终反应体系的体积达到1〇〇 4 。 b•加人20〜34“ 纯化 的rSV4〇病毒。涡旋混合后，瞬时离心。放置在冰上。 c. 置于冰上时，加 人 1〜3M1RQl D N a s e 。 加 人 的 DNase的精确体积需要根据不同批的DNase来 决 定 （参照前面的方法)。 1 2 . 用 D N a s e / R N a s e 酶切质粒 D N A a•混合Im I R Q l D N a s e 反应缓冲液和IfjJ 稀释的R N a s e (5ng/M l)
的 lOmmol/L Tris-HCl使最终反应体系的体积达到10 0 4 。 b•加人IOfxl 5X 106 稀释后的质粒DNA和 20〜 3知 1的 PBS。涡旋混合后，瞬时离 心 。放置在冰上。 c . 始终放在冰上，加 人 1 〜 3 m1 R Q l D N ase。 加 人 的 D N a s e 的精确体积需要根据每一批的DNa s e 来 决 定 （参照前面的方法)。 13•瞬时涡旋混合质粒和病毒样品，瞬时离心。 质粒和病毒的对照反应包含除D N a s e 之外的所有成分。 1 4 . 室温孵育样品20m in。 1 5 . 将管子放回到冰上。每管中加人1 M1 R Q l D N a se终止液。瞬时涡旋混合后离心。 16. 在 75°C孵育反应液IOmin使 DNase失活。瞬时离心，收 集 沉 淀 （condensation)。 使 D N a s e 失 活 对 于 q P C R 过程中防止对引物和模板进行酶切是很关键的。 17•立即用qPCR滴 定 （参照下面的方法）或一80°C储存以备将来使用。 用定量聚合酶链反应滴定（qPCR) 避 免 对 qPCR反应产物的污染是很重要的。在整个过程中都要戴手套，使用带过滤 M 的移液器吸头。如果可能的话，使用一套专门的微量移液器移取试剂，并在与加人模 板时的区域隔开的洁净区域操作。不要接触反应管的边缘和管盖内部。 18;.准备测定标准曲线的1 0 倍系列稀释的质粒DNA，浓 度 5 XIO7〜5 XIO2 个分子 (步 骤 1〜6)。 19. 用无核酸酶的PCR 级别水 按 1 : 500稀 释 ROX。 20. 每 个 反 应 样 品 中 加 人 12. 5fxl2 X 主 反 应 混 合 液 （ master mix)， 5pmol前 向 引 物 ， 5pmol反向引物， 0.375/J 的稀 释ROX对照染色剂，加 人 PC R 级别水调整每个样 品最终体积至23m1。 为标准曲线、要滴定的未知病毒样品和无插人模板对照的每个点准备三份充分的反应混合 液 。考虑到微量移液器的误差，多准备至少一个样品的反应量。 2 1 . 移 取 2 3 M1 上述反应混合液到q P C R 光学管中。小心不要使样品中产生气泡。 22. 在将质粒和病毒样品加入到qPCR反应管之前，先涡旋混合并瞬时离心。 23•加人2^1模 板 （质粒标准曲线和未知病毒）到各管。轻轻吹打混合均勻。避免产生 气泡。加 人 2fil 10mm〇 l/L T r is - H C l到对照管中。 24. 盖上管子，瞬时离心。把管子放到qPCR仪器里。 25. 根据样品模板和雛特性，设 定 q P C R 仪器的程序 （Stategene 2004)。 P C R 设定如下： 9 5°C , IOm in0 95°C ， 30s , 55°C ， 60s ， 72°C ， 30s, 重复 40 个循环。 解 离 曲 线 ：逐 步 增 加 温 度 ， 5 5 〜 9 5 °C ，超 过 30m in。 分 析 qPCR数据 26•将每个标准稀释液的Ct 值以初始模板的量作图。 这一步可以用M x 3O O O P 软件自动进行或者手工使用作图软件（如 Excel) 完成。 ?7•通过与标准曲线比较来确定待滴定的未知样品的初始拷贝数。使用直线方程，而

28. Use the following formula to calculate the number of virus particles per milliliter:
Initial number of copies X 5X 500 = Number of viral copies Anl

29. The purity of the sample is verified from the dissociation curve. A single peak indicates a PCR product.
The purity and size of the PCR product can also be determined by agarose gel electrophoresis.


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